思兰朵荣登国家医学期刊（三）
针对色斑皮肤的化妆品的应用与研究
黄尾全
东莞市厚街医院皮肤科，广东东莞523945
摘要：通过DPPH自由基清除、体外生化实验，验证了天然虾青素、Ve-乙基醚、乳然酸在祛斑过程中的具体功效。三种组分主要是通过清除自由基，抑制L-dopa氧化、影响黑素小体转运方式阻止黑色素生成、聚合、转运、沉积，从而起到淡现、祛斑的功效。选取市售的以天然虾青素、Vc-乙基醚等为主要祛斑成分的祛斑产品，通过志愿者试验证明了思兰朵点肌净顺祛斑精华液的持续祛斑功效，市场反馈口碑良好。
关键词：天然奸青素；Ve-乙基醚；祛斑；思兰朵
中图分类号：TQ658 文献标识码：A
近年来，皮肤美白、祛斑问题备受瞩目。皮肤中的黑色素、氧合血红蛋白、还氧血红蛋白及胡萝卜素等多种生物色素是人类肤色的主要影响因素。黑色素的正常形成，是皮肤的天然保护屏障，即可有效防御紫外线辐射对人体的伤害。
当皮肤发生色素沉积或异常时（过多、过少或缺乏），会导致黄褐斑、白疲风、白化病等色素障碍性皮肤病。
皮肤内黑色素的含量可直接影响肤色的白皙程度，美白和祛斑产品在当前化妆品市场所占比重较大。针对肌肤美白，是黑色素分布较均匀的肌肤整体提升亮度（ITA°值）、白度（L‘值），其活性组分是以调节酪氨酸酶的活性表达为主要方向。而色斑的成因是皮肤局部黑色素过多沉积，单纯以抑制酪氨酸酶活性为主的美白产品是难以达到理想的祛斑效果，清除自由基、阻断黑色素转运、加速角质层剥脱和黑色素排出均是是有效的祛斑途径。
大量研究“证实，抑刺酪氨酸酶活性、清除自由基、阻断黑色素转运、加速角质层剥脱和黑色素排出是有效的祛斑途径。本研究首先选择天然虾青素、Ve-乙基醚和乳糖酸三种活性组分，通过体外实验，研究其抗氧化能力、对黑色素合成的抑制途径、转运途径等在祛斑中的作用功效；选取市传以上述三种维分为主要祛斑活性成分的“国妆特字批另”
祛斑精华液（霜），采用Lab色度系统和皮肤黑色测试仪测量皮肤色度和黑色素含最的变化，通过人体试验评价化妆品祛斑功效，为丰富我国安全祛斑化妆品研究提供科学的参考依据。
1实验部分
1.1有机自由基（DPPH)消除能力测定适量95%乙醇溶解0.070gDPPH试剂，转移至l1.容量瓶乙醇定容，DPPH-乙醇溶液浓度0.1777mmol/L，-17C冷藏备用。
25mL比色管中，按顺序加入10mlDPPH溶液、10ml磷酸盐缓冲溶液（plH-6.88)混合均匀；分别加入不同质量浓度的抗氧化活性组分（天然虾青素、Ve-乙基醚、乳糖酸），去离子水定容，摇匀静置，10min 后测定溶液在517mm处的吸光度A"，自由基清除率（K）：
式中，A-加入抗氧化活性组分、DPH溶液、缓冲溶液后吸光度；A-仅加入抗氧化活性组分、缓冲溶液后的吸光度；A-仅加入DPPH溶液、缓冲溶液后吸光度。
1.2体外活性测定1.2.1活性组分配制天然虾青素经适量乙醇溶解后，Ve-乙基醚、乳糖酸用0.0lmol/LpH=6.84磷酸盐缓冲液稀释至实验所需浓度（10mg/L、20mg/L、30mg/L、40mg/L、50mg/L)。
1.2.2酪氨酸酶活性抑制率的测定磷酸盐缓冲溶液为溶剂制成2.5mmol/LL-酪氨酸溶液，移取65uL至96孔板，继续加入130uL缓冲液及65uL受试物（活性组分溶液），65uL200U/ml.酪氨酸酶（TYR），混匀后30℃保温150min，HPLC测定1-dopa生成量。仅加入 65u1磷酸盐缓冲液为空白测试组。
式中：
S-加酪氨酸酶不加受试物生成L-dopa浓度；S2-空白组生成L-dopa浓度；L-加酪氨酸酶及加受试物L-dopa浓度；L2-无酪氨酸酶但加受试物L-dopa浓度。
色谱条件：InertSustainBio Cs色谱柱（250×4.6mm，5um）；UV检测器-流动相：水-乙酸-甲醇（88：2：10），流速0.8mL/min；FLD-流动相：水-甲酸-乙腈（97:1:2），流速1.0mL/min；检测波长Sig=280，Ref=320；柱温：25℃。
1.2.3L-多巴氧化抑制作用在氧气存在条件下，L-dopa可氧化生成多巴醒，通过紫外分光光度计测定480nm左右多巴醒的吸光度，由此推断活性组分对生成多巴醒影响情况，反应式如图1：
磷酸盐缓冲溶液为溶剂制成1.5mmol/LL-dopa溶液，移取40uL至96孔板，继续加入80uL缓冲液及40uL受试物（活性组分溶液），30℃保温105min，测定490nm处吸光度。仅加入40uL磷酸盐缓冲液为空白测试组。
式中：
C-不加受试物的吸光度；C2-空白组吸光度；T-添加不同浓度受试物的吸光度。
1.2.4B16黑色素细胞增殖活性影响MTT比色法检测细胞活力：选取对数生长期B16黑色素细胞，0.25%胰蛋白酶消化，通过RPMI-1640完全培养基配制细胞悬液（p=1×10°个/mL），100uL/每孔接种于96孔板，3孔/组，共32组，5.0%C02培养箱37℃贴壁培养24h。
样品组分别加入不同浓度活性组分培养液，对照组加入等体积细胞悬浊液，空白组为100uLRPMI-1640培养基。5.0%C02培养箱37℃贴壁继续培养72h，测定酶标仪570nm处吸光度，细胞增殖率：
1.2.5黑素小体转运调控角质形成细胞有原代细胞接种KC-SFM培养基培养。B16黑素细胞经CFDA-SE荧光标记。与角质培养细胞皿内接种5×10°个黑素细胞，细胞接种比例按1：2培养，M245、KC-SFM培养基以1：2混合。共培养24h后，加入含有活性组分培养液，设置空白、对照组，培养120h后，经生化处理后收获细胞，流式细胞仪分析成功发生黑素转运的角质细胞数目，数据进行单因素方差分析。
1.3人体试验法评价祛斑产品功效祛斑类化妆品属于特殊用途化妆品，必须有国妆特字方能进行生产，产品的安全才能得到保证。选取价位区间在80~300元之间的市售祛斑产品1#、2#进行人体试验，两组祛斑产品均以天然虾青素、Ve-乙基醚和乳糖酸为主要活性成分。
1.3.1受试志愿者志愿者：受试者30人，25岁~55岁主要从事室内工作女性，符合《化妆品接触性皮炎诊断标准及处理原则》受试标准。受试者每10人为一样本组（年龄分布均匀，皮肤颜色在II~IV区间）。样本组1#，2#分别测试1#，2#祛斑产品：样本组3#为空白对照组。
1.3.2测试方法测试指标：①皮肤黑色素含量Ml值：MM值表征黑素指数，MI值越大皮肤黑色素含量越高。②皮肤白度（亮度，L'值）：白平衡，值越高颜色越趋向白色，反之则偏向黑色；③个体类型角（ITA°值）：ITA”值由皮肤黑白色度（L值）、红绿色度（a*）、蓝黄色度（b*）计算得到，确定肤色等级，其值越大，肤色明亮（浅），反之，肤色暗沉（深）。
测试方法”：受试者组机选取左、右手臂内侧为受试区，另一侧为对照区，使用祛斑产品点涂色斑部位，每日早晚各涂一次，测试周期共计14周；在测试周期内，受试部位不使用其它任何化妆品。空白对照组不使用任何化妆品。测试分为初始值（0周）及使用祛斑产品1周、2周、8周、14周，受试者使用测试仪器测定涂抹部位数值。SigmaStat 3.5软件进行统计分析，以皮肤黑色素含量（MI值）、L值、ITA°，反应l#、2#产品的祛斑功效。
测试环境：测试温度22℃±1℃，湿度：50%士5%。受试者静待20min后进行测试。
2结果与分析2.1三种活性组分清除DPPH自由基分析大量研究证实，自由基（02、·0H、过氧化脂质等）可氧化聚合皮肤内的不饱和脂肪酸形成类脂褐色素；过量自由基亦会在造成血液微循环障碍，影响皮肤营养供给，致使褐色素过量沉积，皮肤表观会产生晒斑、黄褐斑等：提供可清除自由基的抗氧化活性组分，可有效提高溶酶体酶活性，加快脂褐质氧化分解及黑色素降解，具有淡斑、祛斑效果。
以DPPH自由基抑制率表示活性组分体外抗氧化能力。
由图2可知，天然虾青素、Ve-乙基醚、乳糖酸添加浓度（10mg/L~50mg/L）对DPPH自由基抑制率呈近似线性关系，“随各组分浓度的升高，抑制率的增长趋于平缓。单位质量浓度DPP阳自由基抑制率顺序：天然虾青素>Vc-乙基醚>乳糖酸。
2.2体外活性测试黑色素细胞将生成的黑色素运至表皮基层细胞，随新陈代谢继续转运到角质层，最后同角质化细胞脱落，其合成、转运、清除与黑色素本体细胞及周围角质细胞密切相关，而酪氨酸酶的活性可调控黑色素的产生。因此，抑制酪氨酸酶活性、抑制L-多巴氧化、阻断黑色素转运、加速角质层剥脱和黑色素排出均是祛斑的有效途径。
2.2.1酪氨酸酶活性抑制率分析
三种活性组分在不同浓度下对酪氨酸酶活性抑制相关数据见表1。浓度区间10mg/L~50mg/L，天然虾青素、Vc-乙基醚、乳糖酸对酪氨酸酶活性抑制并不显著，由此推断它们不是通过直接抑制酪氨酸酶活性从而阻断黑色素中间体合成达到祛斑目的。
2.2.2多巴氧化抑制作用分析由图3可知，在10mg/L~50mg/L浓度区间内，天然虾青素、Ve-乙基醚、乳糖酸均可抑制L-多巴向多巴醒转化，随浓度升高，氧化抑制率增长变化趋于平缓，组间对比显著。
相同浓度下，天然虾青素的氧化抑制效果最强，Ve-乙基醚次之，乳糖酸最弱。天然虾青素、Ve-乙基醚可粹灭多巴氧化过程中产生的自由基，有效阻止黑色素中间体多巴配的生成，控制黑色素的生成，从而达到淡斑、祛斑的目的，同时可有效预防色斑的再次生长。
图3不同活性物质多巴氧化抑制情况
2.2.3B16黑色素细胞增殖活性分析天然虾青素、Vc-乙基醚、乳糖酸三种活性组分对小鼠B16黑色素瘤细胞增殖活动相关数据见表2。在10mg/L～50mg/L浓度范围内，三种活性组分对B16黑色素瘤细胞的正常生长增值没有显著的抑制作用。这也从侧面说明了天然虾青素、Ve-乙基醚、乳糖酸对细胞无抑制毒性，避免因黑色素细胞不足引起的皮肤病变损伤，可作为安全的化妆品添加成分。
2.2.4黑素小体转运调控分析天然虾青素、Vc-乙基醚、乳糖酸三种培养组分对共培养体系中黑素小体转运影响，如表3所示，生理盐水对照组的黑素小体转运率为31.41%，天然虾青素、Vc-乙基醚、乳糖酸处理后的共培养体系黑素小体转运率降低，分别为21.77%、19.96%、20.38%。抑制黑素小体转运顺序为：Vc-乙基醚>乳糖酸>天然虾青素。三种活性组分可通过抑制黑色素小体转运，减少黑色素在皮肤角质层的过量沉积，达到祛斑的功效。另外，也有研究表明，乳糖酸作为第三代果酸，亲水保湿渗透能力强，在低浓度下可软化皮肤角质层，适当提高浓度可加速剥离老化角质层。
2.3祛斑功效评价2.3.1盲测祛斑情况受试部位按样本组分别涂覆相应祛斑产品后，皮肤均无红斑、焦痂、水肿等刺激性反应，样品组测试均值与初始值对比，如图4所示。
皮肤黑白色度（L值）：0周~2周内，使受试部位测试变化不明显；10周后，1#祛斑产品受试部位L值变化幅度较大；实验周期后，受试部位L值升高幅度依次为：1#>2#～3#。经统计学计算，全实验周期，使用1#产品受试部位前后L*值存在显著差异（p<0.05)，1#产品变化差异不明显（P>0.05）。可证明1#祛斑产品可以提升肌肤白度，2#产品不影响原有肤质白度。
ITA°值：实验周期内，受试部位ITA°值变化与初始值变化差异不明显（P>0.05）。
皮肤黑色素含量Ml值：实验周期内，使用两组产品受试部位MI值与初始值均有显著性差异（0.01<P<0.05）。
使用1#祛斑产品在使用6周时，MI值明显降低，受试部位色斑淡化。使用2#产品，MI值在第二周就有明显变化，之后变化趋势平缓。全实验周期后，受试部位MM值依次为：
1#>2#>3#。由此证明，1#产品可有效淡化黑色素，祛斑效果明显。
2.3.2祛斑产品评述对含有天然虾青素、Ve-乙基醚、乳糖酸活性组分的祛
斑产品盲测结果表明，1#产品淡化黑色素、祛斑效果明显。
1#祛斑产品名称为思兰朵点肌净颜祛斑精华，是在天猫上筛选出的以天然虾青素、Ve-乙基醚、乳糖酸为主要祛斑成分的祛斑产品，通过志愿者样本试验证明了该产品的持续祛斑功效，并且作用温和、肌肤刺激性低。此类祛斑产品适合色斑较重的人，但严重的色素障碍性皮肤疾病，应及时就医，积极配合诊疗。
3总结通过DPPH自由基清除、酪氨酸酶活性抑制、L-多巴氧化抑制、B16黑色素细胞增殖活性影响、黑素小体转运调控等体外生化实验，验证了天然虾青素、Ve-乙基醚、乳糖酸在祛斑过程中的具体功效。天然虾青素对DPPH自由基抑制最强，通过粹灭自由基抑制L-dopa氧化生成多巴醒，从而抑制黑色素的生成。Ve-乙基醚是Vc的衍生物，可清除DPPH自由基、阻止L-dopa氧化、还原黑色素中间体和黑色素的聚合物来抑制黑色素的生成和转运。乳糖酸作为第三代果酸，有一定的抗氧化活性，可抑制黑素小体转运，亲水保湿能力强。
化妆品市场中的祛斑产品种类繁多，以天然虾青素、Vc-乙基醚为主要祛斑成分的思兰朵点肌净颜祛斑精华液，通过志愿者试验证明了该产品的持续祛斑功效，市场反馈口碑良好，为化妆品行业树立的祛斑产品的标杆。
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作者简介：黄尾全（1978一），男，江西抚州人，汉族，硕士研究生，研究方向为免疫相关性皮肤病。
